Ang fluorescence filter ay isang mahalagang bahagi sa fluorescence microscope. Ang isang karaniwang sistema ay may tatlong pangunahing mga filter: isang filter ng paggulo, isang filter ng paglabas at isang dichroic na salamin. Ang mga ito ay karaniwang nakabalot sa isang kubo upang ang grupo ay maipasok nang magkasama sa mikroskopyo.
Paano gumagana ang isang fluorescence filter?
Filter ng Excitation
Ang mga filter ng paggulo ay nagpapadala ng liwanag ng isang partikular na wavelength at hinaharangan ang iba pang mga wavelength. Magagamit ang mga ito upang makagawa ng iba't ibang kulay sa pamamagitan ng pag-tune ng filter upang payagan lamang ang isang kulay. Ang mga filter ng paggulo ay may dalawang pangunahing uri - mga filter ng long pass at mga filter ng band pass. Ang exciter ay karaniwang isang bandpass filter na pumasa lamang sa mga wavelength na hinihigop ng fluorophore, kaya pinapaliit ang paggulo ng iba pang pinagmumulan ng fluorescence at hinaharangan ang liwanag ng paggulo sa fluorescence emission band. Tulad ng ipinapakita ng asul na linya sa figure, ang BP ay 460-495, na nangangahulugan na maaari lamang itong dumaan sa fluorescence ng 460-495nm.
Ito ay inilalagay sa loob ng illumination path ng isang fluorescence microscope at sinasala ang lahat ng wavelength ng light source maliban sa fluorophore excitation range. Ang filter na minimum transmission ay nagdidikta sa liwanag at ningning ng mga imahe. Ang pinakamababang 40% transmission para sa anumang excitation filter ay inirerekomenda upang ang transmission ay ideal na >85%. Ang bandwidth ng excitation filter ay dapat na ganap na nasa loob ng fluorophore excitation range upang ang center wavelength (CWL) ng filter ay mas malapit hangga't maaari sa peak excitation wavelength ng fluorophore. Ang filter ng paggulo optical density (OD) ay nagdidikta ng kadiliman ng larawan sa background; Ang OD ay isang sukatan kung gaano kahusay na hinaharangan ng isang filter ang mga wavelength sa labas ng saklaw ng transmission o bandwidth. Ang isang minimum na OD na 3.0 ay inirerekomenda ngunit isang OD na 6.0 o mas mataas ay perpekto.
Filter ng Emisyon
Ang mga filter ng emission ay nagsisilbi sa layunin na payagan ang kanais-nais na fluorescence mula sa sample na maabot ang detector. Hinaharang nila ang mas maiikling wavelength at may mataas na transmission para sa mas mahabang wavelength. Ang uri ng filter ay nauugnay din sa isang numero, hal. BA510IF sa figure (interference barrier filter), ang pagtatalaga na iyon ay tumutukoy sa wavelength sa 50% ng maximum transmission nito.
Ang parehong mga rekomendasyon para sa mga filter ng paggulo ay totoo para sa mga filter ng paglabas: pinakamababang transmission, bandwidth, OD, at CWL. Ang isang emission filter na may perpektong CWL, minimum transmission, at OD na kumbinasyon ay nagbibigay ng pinakamaliwanag na posibleng mga larawan, na may pinakamalalim na posibleng pagharang, at tinitiyak ang pagtuklas ng pinakamahinang signal ng emission.
Dichroic Mirror
Ang dichroic mirror ay inilalagay sa pagitan ng excitation filter at emission filter sa isang 45° na anggulo at sumasalamin sa excitation signal patungo sa fluorophore habang nagpapadala ng emission signal patungo sa detector. Ang mga ideal na dichroic na filter at beam splitter ay may matalas na mga transition sa pagitan ng maximum reflection at maximum transmission, na may >95% reflection para sa bandwidth ng excitation filter at isang transmission na >90% para sa bandwidth ng emission filter. Piliin ang filter na nasa isip ang intersection wavelength (λ) ng fluorophore, para mabawasan ang stray-light at ma-maximize ang fluorescent image signal-to-noise ratio.
Ang dichroic mirror sa figure na ito ay ang DM505, kaya pinangalanan dahil 505 nanometer ang wavelength sa 50% ng maximum na transmission para sa mirror na ito. Ang transmission curve para sa salamin na ito ay nagpapakita ng mataas na transmission sa itaas 505 nm, isang matarik na pagbaba ng transmission sa kaliwa ng 505 nanometer, at maximum na reflectivity sa kaliwa ng 505 nanometer ngunit maaari pa ring magkaroon ng ilang transmission sa ibaba 505 nm.
Ano ang pagkakaiba sa pagitan ng mga filter ng long pass at band pass?
Ang mga filter ng fluorescence ay maaaring nahahati sa dalawang uri: long pass (LP) at band pass (BP).
Ang mga long pass filter ay nagpapadala ng mahabang wavelength at hinaharangan ang mas maikli. Ang cut-on na wavelength ay ang halaga sa 50% ng peak transmission, at lahat ng wavelength sa itaas ng cut-on ay ipinapadala ng mga long pass filter. Ang mga ito ay madalas na ginagamit sa mga dichroic na salamin at mga filter ng paglabas. Ang mga filter ng longpass ay dapat gamitin kapag ang application ay nangangailangan ng maximum na koleksyon ng emisyon at kapag ang spectral na diskriminasyon ay hindi kanais-nais o kinakailangan, na sa pangkalahatan ay ang kaso para sa mga probe na bumubuo ng isang solong naglalabas na species sa mga specimen na may medyo mababang antas ng background autofluorescence.
Ang mga band pass filter ay nagpapadala lamang ng isang partikular na wavelength band, at hinaharangan ang iba. Binabawasan ng mga ito ang crosstalk sa pamamagitan ng pagpapahintulot lamang sa pinakamalakas na bahagi ng fluorophore emission spectrum na maipadala, binabawasan ang ingay ng autofluorescence at sa gayon ay pinapabuti ang ratio ng signal-to-noise sa mga sample na autofluorescence na may mataas na background, na hindi maaaring ibigay ng mga long pass na filter.
Ilang uri ng fluorescence filter set ang maibibigay ng BestScope?
Kasama sa ilang karaniwang uri ng mga filter ang asul, berde, at ultraviolet na mga filter. Gaya ng ipinapakita sa talahanayan.
| Set ng Filter | Filter ng Excitation | Dichroic Mirror | Barrier Filter | LED lamp na Haba ng Alon | Aplikasyon |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Fluorescent antibody method · Acidine orange: DNA, RNA · Auramine: Tubercle bacillus ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescent antibody method ·Propidium iodide: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Auto-fluorescence pagmamasid · DAPI: DNA staining ·Hoechest 332528, 33342: ginagamit para sa Chromosome staining |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Catecholamines · 5-hydroxy tryptamine ·Tetracycline: Skeleton, Ngipin |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Ang mga filter set na ginagamit sa mga fluorescence acquisition ay idinisenyo sa paligid ng mga pangunahing wavelength na ginagamit sa mga fluorescence application, na nakabatay sa mga pinaka ginagamit na fluorophores. Para sa kadahilanang ito, pinangalanan din ang mga ito sa fluorophore na inilaan para sa imaging, tulad ng DAPI (asul), FITC (berde) o TRITC (pula) na mga filter na cube.
| Set ng Filter | Filter ng Excitation | Dichroic Mirror | Barrier Filter | LED lamp na Haba ng Alon |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Pula ng Texas | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Paano ka pipili ng fluorescence filter?
1. Ang prinsipyo ng pagpili ng fluorescence filter ay hayaan ang fluorescence/emission light na dumaan sa dulo ng imaging hangga't maaari, at ganap na harangan ang excitation light nang sabay, upang makuha ang pinakamataas na ratio ng signal-to-noise. Lalo na para sa aplikasyon ng multiphoton excitation at total internal reflection microscope, ang mahinang ingay ay magdudulot din ng malaking interference sa imaging effect, kaya mas mataas ang pangangailangan para sa signal to noise ratio.
2. Alamin ang excitation at emission spectrum ng fluorophore. Para makabuo ng fluorescence filter set na bumubuo ng de-kalidad, mataas na contrast na imahe na may itim na background, ang mga filter ng excitation at emission ay dapat makamit ang mataas na transmission na may kaunting passband ripple sa mga rehiyon na tumutugma sa mga fluorophore excitation peak o emissions.
3. Isaalang-alang ang tibay ng mga filter ng fluorescence. Ang mga filter na ito ay dapat na hindi tinatablan ng matinding ilaw na pinagmumulan na bumubuo ng ultraviolet (UV) na ilaw na maaaring humantong sa "burnout", lalo na ng exciter filter dahil ito ay sumasailalim sa buong intensity ng pinagmulan ng pag-iilaw.
Ang Iba't ibang Fluorescent Sample na Larawan
Ang mga mapagkukunan ay kinokolekta at inayos sa Internet, at ginagamit lamang para sa pag-aaral at komunikasyon. Kung mayroong anumang paglabag, mangyaring makipag-ugnayan sa amin upang tanggalin.
Oras ng post: Dis-09-2022